Lipozomii
Lipozomul. Conceptul de lipozom, istoric, structură, compoziție
Lipozomii reprezintă niște vezicole formate din unul sau mai multe straturi bipidice de fosfolipide. El este creat artifical, prezintă o formă sferică care delimitează mediul interior de cel exterior(ambele fiind apoase) prin unul sau mai multe bistraturi fosfolipidice. Cu alte cuvinte structura unui liposom este foarte similară cu cea a unei celule diferența fiind că nu prezintă multitudinea de enzime, substanțe, organite procese și forme diverse care prezintă o celulă, însă este exact la fel cu membrana celulară. Unitatea de bază din care este compus lipozomul este fosfolipidul. Lipozomul nu trebuie confundat cu lizozomul care este un organit celular aparte ce este prezent în mod natural în celulel vii.
Lipozomul ca unitate strucurală de bază un anumit tip de fosfolipidă non-toxică organismului uman, dependentă de tipul de lipozom și destinația acestuia. Fosfolipidele după cum știm au o structură formată din cap polar, schelet fosfat și glicerol și coadă non-polară formată din lanțuri de acizi grași.
Această structură le permite să se asocieze în bistraturi lipidice stabile după următorul mecanism: Capul polar al acestuia se orientează către partea apoasă deoarece, apa fiind un solvent polar, stabilește cu acesta legături de H și îl stabilizează. Regiunea hidrofobă formată din lanțuri de acizi grași, fiind non-polară, se orientează spre interior. Drept rezultat obținem un bistrat lipidic unde mijlocul reprezintă o zonă non-polară în care pot fi dizolvați compuși solubili în solvenți non-polari și o regiune polară.
Se poate observa că structura este similară cu cea a membranei palsmatice a unei celule, de asemenea aceasta poate fi stabilizată prin inserarea moleculelor de colesterol care îi conferă o stabilitate mecanică și termică mai mare. Cele mai utilizate fosfolipide în producerea lipozomilor sunt: Phosphatidylcholine, Phosphatidylethanolamine, însă pot fi folosite și alte tipuri de fosfolipide dependente de proprietățile ce se doresc să i se confere lipozomului. Tipul de fosfolipide determină rigiditatea sau fluiditatea bistratului. Spre exemplu, speciile de phospodylcolina nesaturată din surse naturale, cum ar fi soia sau ouă, formează bistraturi mult mai permeabile și mai puțin stabile în timp ce fosfolipidele saturate cu lanțuri acil lungi (dipalmitoylphos phatidylcholine) formează bistraturi rigide și greu penetrabile.
Desigur proprietățile liposomilor sunt influențate nu numai de către natura fosfolipidelor dar și de către încărcătură, mărime, metodă de preparare, alți compuși care se adaugă.
Lipsomii, după cum s-a menționat anterior, au o formă sferică cu un miez apos care este delimitat de restul mediului prin una sau mai multe straturi bilipidice. Substanțele care sunt dizolvate în mierzul apos al liposomului nu pot penetra bistratul lipidic și respectiv râmân încapsulate în liposom. Prin acest mecansim liposomul poate fi încărcat cu diverși compuși pentru a fi transportați prin organismul uman direct la locul unde ele trebuie să-și manifeste efectul terapeutic. Această structură permite transportarea diferitor substanțe, cum ar fi medicamente, nutrienți, molecule de AND. Substanțele cu caracter hidorofob pot fi încapsulate în bistratul lipidc, respectiv acesta poate fi utilizat ca mediu de transport.
Lipozomii variază, ca mărime, de la 30nm până la cățiva micrometri. De fapt, unul din criteriile de bază prin care sunt clasificați este reprezentat de mărime și de numărul de bistraturi lipidice,pe care, în continuare, le vom denumi lamele.
Clasificarea liposomilor după mărime și structură
În dependență de numărul de lamele a acestora și de dimensiuni, liposomii se pot clasifica în liposomi: multilamelari, oligolamelari și unilamelari. Cei unilamelari la rândul lor pot fi: SUV (small unilamelar vesicles = 20-100nm), MUV (Medium unilamelar vesicles), LUV (Large unilamelar vesicles > 100nm), GUV (Giant unilamelar vesicles > 1micorM) și MVV (Multi vesicular vesicules).
Liposomii multilamelari au mai multe bistraturi lipidice unul în celălalt, în timp ce în cazul liposomilor oligolamelari numărul de bistraturi lipidice este pănă la 10. La cei unilamelari este prezent doar un singur strat. Desigur numărul de lamele și dimensiunea sunt parametri importanți care determină gradul de stabilitate a liposomului, perioada de înjumătățire post administrare (circulation half-life), și cantitatea de medicament care poate fi încărcată în liposomi. Spre exemplu: liposomii multilamelari prezintă avantaj de stabilitate și de o perioadă de circulație sistemică mai lungă, din cauza faptului că sunt prezente mai multe lamele șansa unei rupturi spontane (cu eleberarea medicamentului în sistem și nu la țesutul țintă), este mică. De asemenea, este mai mică și posibilitatea trecerii medicamentului în circulație prin procese naturale de difuzie. Dezavantajele unei asemenea structuri sunt desigur capacitatea limitată de încărcare a liposomului. Dacă spațiul apos din interior e mai limitat putem încărca o cantitate mai mică de medicament, însă după cum se știe orice medicament are nevoie de o doză minimă activă pentru a avea efect. Un alt dezavantaj este și un cost mai ridicat al producerii.
Cei unilamelari sunt mai ieftini și ușor de produs, au o cpacitate de încărcare (loading capacity) mai ridicată, însă având o singură lamelă sunt instabili, se pot rupe mai ușor, medicamentul poate ajunge în sistem și poate manifesta acele efecte adverse și citotoxice nedorite. Plus o cantitate mică de medicament trece în sistem prin difuzie. Acești parametri desigur variază în funcție de mărimea liposomului. Liposmii SUV au un clerence half life mai redus decât MUV sau GUL dar și un loading capacity mai redus. În genral LUV și GUV au aplicații clinice reduse și sunt utilizați mai mult în nutriție. În medicină sunt aplicați mai des MLL, OLL și SUV.
Tipurile de liposomi
Liposomii pot fi de mai multe tipuri:
- convenționali
- Stealth (Long circualting)
- Targeted liposomes(liposomi pentru un anumită țintă tisulară)
- Liposomi cationici
- Liposomi termo senzitivi(TSL)
- Liposomi Ph-Senzitivi.
Îi vom descrie pe fiecare în parte.
Liposomii convenționali reperezintă varinata clasică de liposomi unilamelari sau multilamelari. Aici, după cum s-a menționat anterior, se folosesc fosfolipide cum e phosfodilcolenia. Lipozomii compuși din fosfolipide cu lanțurile de acizi grași saturați prezintă o stabilitate mai mare decât cei cu compuși din fosfolipide cu lanțuri de acizi grași nesaturați. Acest efect s-a observat pe compușii din fosfodil colină. Explicația este o temepratură de tranziție lichid-cristalin, mai mare (liquid crystalline transition temperature). Inserarea moleculelor de colesterol conferă de asemenea stabilitate și împiedică degenerarea lamelară prin asocierea fosfolipidelor cu HDL și LDL din serum.
Asocierea lemelară cu LDL și HDL prezintă una din limitările principale ale lipozomilor cât și acțiunea sistemului fagocitar mononuclear(mononuclear phagocyte system, MPS) care duce la eliminarea rapidă a acestora din circulație. Desigur aici trebuie menționată și o altă caracteristică importantă a lipozomilor cum este încărcătura electrică. Lipozomii încărcați neutru au un timp de circulație mai mare în sistem față de cei încărcați negativ. Lipozomii încărcați pozitivi prezintă un grad de toxicitate și sunt rapid eliminați din circulația sistemică.
Una din principalele probleme în aplicare liposomilor o reperezintă recunoașterea și eliminarea acestora de către sistemul fagocitar mononuclear(mononuclear phagocyte system, MPS). Pentru a depăși această problemă în lamela liposomală este încorporată poly-(ethylene glycol) (PEG). Se speculează că mecanismul prin care acest lucru are loc îl reprezintă stabilizarea sterică a membranei lanțurile flexibile de PEG ocupă locurile din imediata apropiere de pe suprafața memebranei lipozomale, astfel proteinele de recunoaștere cum sunt opsoninele se atașează membranei mai greu și recunoașterea se face mai lent. Recunoașterea lipozomilor de către MPS se datorează în mare parte acestor proteine. Reprezintă liposomi cuplați cu Mab (anticorpi monoclonari), sau fragmente de peptide sau factori de creștere sau glicoproteine, carbohidrații. Aceasta le oferă posibilitatea de a se acumula într-un țesut specific. Astfel se obține un efect terapeutic mult mai pronunțat. Din cauză că pe suprafața liposomilor sunt situați anticorpi specifici unui tip de țesut sau celulă se facilitează absorbția și înglobarea liposomilor în celulă sau țesut. Rezultatul este acumularea liposmilor în țesutul țintă.
Sunt folosiți în tratamentul cancerului din considerentul specificității și faptului că au o capacitate mult mai mare de a se acumula în celulele tumorale. Mai mult de atât, un avantaj major a acestor tipuri de liposomi îl prezintă faptul că este posibil de mărit numărul de anticorpi și de liganzi și prin aceasta să se mărească capacitatea de absorbție a medicamentului încapsulat.
Liposomii cationici reprezintă liposomii care încapsulează molecule de ADN plasmidial care codifică pentru o proteină de interes. Sunt liposomi utilizați în terapia genică folosiți ca vectori de transfer. Țelul acestori liposomi este de a furniza ADN plasmidial celulelor țintă pentru ca acestea eventual să-l înglobeze în propriul ADN și să înceapă să exprime o proteină de interes (de regulă terapeutic). Sunt obținuți prin stabilizarea moleculei de ADN în cadrul liposomului.
După cum știm, ADN are sarcină negativă, deci se caută fosfolipide a căror cap hidrofil are încărcătură pozitivă pentru a obține efectul stabilizator în interiorul moleculei. Elementele cele mai importante care trebuie laute în considerare la alegerea tipului de fosfolipid din care va fi compus stratul sunt:
Capul hidrofil încărcat pozitiv
Gruparea linker care determină stabilitatea și biodisponibilitatea
O regiune hidrofobă care va permite crearea stratului bilipidic. În cazul acesta, cel mai des folosite sunt amestecul între: N-[1-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium (DOTMA) și dioleoylphophatidylethanolamine (DOPE) într-o proporție de 1:1
Sunt folosiți în cadrul terapiei genice și tratamentului de cancer.
Liposomii termo-senzitivi și pH-senzitivi
Liposomii termo-senzitivi reperezintă acei liposomi care își eliberează conținutul atunci când temeperatura crește cu câteva grade mai sus decât temperatura fiziologică. Se obțin folosind fosfolipide specifice care se degradează la o temperatură mai mare. Eliberarea conținutului liposomal se poate obține prin încălzirea tipică de suprafață sau încălzirea celulelor tumorale la o temperatură de 40-42 grade C folosind infraroșu.
Cei senzitiv la PH au același efect doar că în dependență de pH. La pH fiziologic sunt stabili, pH fiziologic fiind de 7,4. În unele forme de cancer pH-ul în apropiere de tumoare este acid. În aceste condiții liposomii sunt înglobați și eliberează conținutul lor în țesutul tumoral.
Metodele de preparare a liposomilor:
Metode generale de preparare
Toate metodele de preparare a liposomilor implică 4 stadii :
- Uscarea lipidelor aflate într-o suspensie de solvent organic
- Dispersarea lipidelor într-un mediu apos
- Purificarea liposomilor care au rezultat
- Analizarea produșilor finali.
Metodele de preparare a liposomilor și de încărcare a acestora cu medicamente
- Tehnici de încărcare pasive.
- Tehnici de încărcare active.
Tehnicile pasive includ:
- Dispersia mecanică
- Dispersia în solvent
Metoda de dispersie mecanică :
-
- Sonicarea
- Extrudare
- Hidratarea filumului lipidic
- Micro-emulsificarea
- Extrudare membranară
-
Sonicare reprezintă metoda cea mai des întâlnită și cea mai vast utilizată în pregătirea SUV (small unilamelar liposomes). Aici liposomii multilamelari sunt supuși procesului de sonicare într-o baie de apă. Dezavantajul acestei metode constă în volumul mic de producere, contaminarea cu MLV (multilamellar vesicles), poluare cu metale de la utilajul de producere.
Extrudarea este o metodă ceva mai eficientă față de sonicare. Constă în trecerea MLV printr-un mic orificiu sub presiune. Spre deosebire de sonicare, nu are loc degradarea proteinelor în urma tratării cu ultrasunete. Dezavantajele sunt reprezentate de volume mici de producție cât și de o temperatură înaltă necesară procesului.
Metode de dispersare în solvent:
Injectarea cu eter: Soluția lipidică este disolvată în dietil eter sau amestec de eter-metanol. Apoi, gradual, este injectată într-o soluție apoasă în care este dizolvat materialul ce urmează a fi încapsulat. Procesul are loc la o temperatură de 55 -65 grade C. Apoi are loc eliminarea eterului în vacuum și crearea liposomilor. Dezavantajul este expunerea materialului din interiorul liposomului la solvenți organici și la o temperatură ridicată.
Injectarea cu etanol: O soluție de lipide dizolvată în etanol este injectată rapid într-un volum de soluție tampon. Formarea MLV este imediată, însă dezavantajul constă în eliminarea ulterioră a etanolului, care este laborioasă și ineficientă.
Evaporarea prin fază inversă: aceasta este o metodă mai bună și mai modernă de preparare a liposomilor. Metoda se bazează pe crearea miceliilor inversate. Acestea sunt supuse ulterior sonicării într-o soluție tampon apoasă ce conține substanța dorită a fi încapsulată. Crearea liposomilor prin această metodă necesită o metodologie specială cât și utilaj de înaltă performanță. Unul din marele avantaje ale acestei metode îl reprezintă faptul că pot fi utilizate diferite tipuri de fosfolipide și repsectiv crearea liposmilor de mai multe tipuri cu funcții mai variate.
Liposomii, de asemenae, mai pot fi produși folosind gel cromatografia și procesul de dializă.
Utilizarea liposomilor:
Liposomii pot fi utilizați în diverse domenii, de la cercetare până la industria alimentară. Aici ne vom focusa strict pe utilizarea acestora în biochimie și în domeniul medical.
Liposomii sunt utilizați în ziua de azi pentru tratarea unor forme de cancer cât și pentru tratarea unor infecții sistemice.
Liposomii sunt folosiți pentru tratarea infecțiilor fungice sistemice cu amphotericin B, un agent antifungic care are efecte toxice puterncie asupra organsimului. Administrarea acestuia, cu ajutorul liposomilor, permite eliberarea treptată și țintită a acestuia în celule macrofage și în felul ăsta prevenirea expunerii sistemice la medicament. Astfel, elementele toxice ale acestuia sunt parțial sau majoritar mitigate. Sunt numeroase studii cu folosirea liposomilor și a medicamentului amphotericin B în tratamentul leihsmaniozei, o boală din zonele tropicale provocată de protozoare.
Liposomii, sunt de asemena utilizați în tratarea diferitor tipuri de cancer. Medicamentele încapsulate în liposomi manifestă o toxicitate mult mai redusă decât cele administrate sistemic în stare liberă. Acest lucru scade severitatea efectelor adverse, toxicitatea organismului și speranța de viață a individului după terapie. Un bun exemplu il reprezintă medicamentul Adriamycin. Acesta oprește diviziunea celulară prin intercalarea cu AND-ul acestora. Din păcate el manifestă o toxicitate ridicată pentru multe alte tipuri de celule din organismul uman, în special pentru cardiocite. Adminsitrarea cu liposomi a oferit o mai bună toleranță la medicament cât și o reducere în severitatea efectelor adverse.
Diverse formulări liposomale sunt folosite în tratarea lymphomei Hodghin, Kaposi’s sarcoma și altor forme de cancer.
Liposomii sunt de asemene utilizați ca agenți de detoxifiere. Sunt studii în care se încearcă utilizarea liposomilor goi, adică fără încărcătură cu medicamente pentru elimianrea mai rapidă a unor substanțe toxice.
Liposomii cationici, după cum s-a menționat anterior, pot fi folosiți în terapie genică în calitate de vectori de transfer pentru a transfera ADN plasmidial la celula țintă. În felul acesta se obține expresia proteinei de interes cu rol terapeutic
Bibliografie:
Studenți: Andrada NIȚU și Lucian IORGA
Secţia Biochimie, Anul III, Facultatea de Biologie, Universitatea din Bucureşti