Fibroza chistică este o boală fatală autozomal recesivă ce afectează mai ales populațiile caucaziene, cu aproximativ 70 000 de pacienți în toată lumea. Obstrucționarea cronică a căilor respiratorii duce la deces în 80% din cazuri. Este o boala afectată de mutația genei CFTR, reglatorul de conductanță în fibroza chistică, se caracterizează prin obstrucționări multiple ale plămânilor și este una dintre cele mai comune și mortale boli ereditare din lume.

Boala este cauzată de mutații la nivelul unei genei situate pe brațul lung al cromozomului 7 (7q31), care codifică o proteină transmembranară, CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), ce face parte din familia proteinelor cu activitate ATP-azică și funcționează ca un canal de clor la nivelul polului apical al membranei celulelor epiteliale. Trecerea prin CFTR este reglată obligatoriu prin fosforilare pentru activarea canalului și trecerea prin canal este controlată prin legarea ATP-ului de domenii intracelulare specifice din proteina CFTR.

Arhitectura proteinei CFTR este constituită din patru domenii: două domenii transmembranare MSD1 și MSD2 și două domenii ce leagă nucleotide (NBD1 și NBD2). Fiecare MSD are șase segmente transmembranare helicale (TM1-TM6 și TM7- TM12), fiecare domeniu transmembranar fiind urmat de un domeniu de legare pentru nucleotidă. Canalele CFTR fosforilate arată o activitate care de obicei crește la deschideri și durează sute de milisecunde. Durata și frecvența acestor creșteri sunt strict dependente de concentrația de ATP intracelular. În contrast cu alte tipuri de canale ionice, probabilitatea de deschidere a CFTR este afectată moderat de potențialul membranar.

Rolul CFTR a fost descris cel mai bine la celule epiteliale: conduce anioni, în mare parte clor și bicarbonat, de-a lungul celulelor epiteliale și membranei apicale, mutațiile CFTR ce afectează funcția canalul ionic duc la o reglare disfuncțională a fluidului epitelial și a transportului de sare în plămâni, pancreas și alte organe. S-au dezvoltat multiple tehnici ce evaluează transportul ionic în celule pentru a oferi informații cu privire la proprietățile fiziologice ale CFTR. Standardul pentru CFTR este tehnica patch-clamp ce analizează comportamentul molecular al canalului anionic CFTR.

Până în prezent au fost descrise mai mult de 1500 mutații diferite, aproape toate fiind mutații punctiforme sau deleții mici (de la 1 la 84 pb). Mutațiile sunt împărțite în șase clase, clasa I: proteina nu este sintetizată, clasa II: CFTR este insuficient prelucrată la nivelul aparatului Golgi, clasa III: proteina nu este funcțională, clasa IV: CFTR prezintă conductanță anormală, clasa V: CFTR prezintă un defect parțial de sinteză, clasa VI: CFTR este degradată accelerat. Mutațiile din clasele I, II, III sunt mai frecvente și se asociază cu insuficiență pancreatică, în timp ce mutațiile din clasele IV, V și VI sunt mai rare, iar pacienții nu prezintă manifestări pancreatice.

Consecința anomaliilor genetice este reprezentată de absența sau funcționarea inadecvată a canalelor de clor la nivel celular, ceea ce se traduce prin alterarea transportului clorurilor în glandele mucoase și seroase de la nivelul majorității organelor. Aceste secreții vor avea un conținut scăzut de apă, vor fi vâscoase, aderente la epiteliile ductelor excretoare și greu de eliminat spre exterior. Acumularea acestora produce în timp alterarea funcțiilor și distrugerea diferitelor organe (plămâni, pancreas, ficat, intestin, organe de reproducere). La nivelul pielii apare o secreție sudorală cu concentrație ridicată de sare.

CFTR este o glicoproteină cu o secvență de 1480 de aminoacizi, a cărei sinteza începe în reticulul endoplasmic și cere plierea coordonată a domeniilor în 3 compartimente distincte, în membrana reticulului, în lumenul acestuia și în citosol. Compartimentarea are loc din ribozom. Asamblarea domeniilor transmembranare și nucleotidice în structurile pliate durează 30-120 de minute și e facilitată de o cohortă de complexe citosolice și lumenale cum as fi Hsp70, Hsp40 Hsp90, calnexina și altele. Dacă CFTR-ul nu reușește să se plieze normal, aceste complexe cum ar fi Hsp70 vor recruta enzime care vor ținti mutația pentru a fi degradată protozomal. Orchestrarea atenta a transloconului ribozomal asigură apariția domeniilor solubile fie în citosol, fie în lumenul reticulului și integrarea transmembranei într-un bistrat. TM3 si TM4 se inserează în translocon într-un hairpin elicoidal, un mecanism similar fiind propus și pentru restul subunităților transmembranare.

Este deci nevoie de o pliere corectă a domeniilor CFRT pentru o asamblare corectă. Mutațiile care cresc solubilitatea sau stabilitatea termodinamică a NBD1 și care scad flexibilitatea structurii pot crește plierea NBD1 în celule. Un pas important în CF (cystic fibrosis) este identificarea moleculelor mici care funcționează în acești pași de pliere și îmbunătățirea funcției canalelor în pacienții cu fibroza chistică.

O metoda buna de a defini tranzițiile de pliere este de a măsura prin fluorescență de transfer de energie (FRET) dintre probele donor și acceptor, care sunt incorporate pe situsuri distante în secvența primară, dar care devin mai apropiate unul de altul pe parcursul plierii proteinei. Mutația fenilalaninei destabilizează structura NBD1 și intervine cu plierea NBD2, TMD1 si TMD2, modifică interacțiunile dintre NBD1 și ICL4 și compromite această asamblare între domenii.

Terapii

S-au studiat numeroase terapii și agenți farmacologici care să vină în ajutorul pacienților ce suferă de CF, însă e important de reținut că pentru fiecare terapie contează foarte mult tipul de mutație care a avut loc la nivelul proteinei.

Terapia genică implică relocarea copiilor genei CFTR într-un strat de celule epiteliale din căile respiratorii cu scopul de a înlocui gena ce a suferit mutații și a exprima proteină CFTR funcțională.

Un modulator CFTR este un agent farmaceutic ce țintește un defect specific în proteina CFTR care cauzează mutația. Nu corectează mutații în genă, ci erori ce apar post-transcripțional.

Potențiatorii sunt agenți terapeutici care cresc probabilitatea de deschidere a canalului și potențează deschiderea și transportul din perspectiva canalului ionic CFTR pentru Cl.

Terapia cu celule stem are propriile sale obstacole, mai exact trebuie determinat ce celule relevante vor fi capabile să repare defectul.

Metoda CRISPR/Cas9 a obținut recuperarea totală a funcției proteice în celule stem intestinale derivate din copii cu fibroza chistica. Această tehnologie cere timp și foarte multă muncă pentru a obține celule pulmonare bine diferențiate.

Terapia mediată cu ARNm în care este țintită o nucleotidă ce codează pentru CFTR și este țintită în citoplasma celulei. Se aduce în celulă utilizându-se vectori non-virali lipozomali sau polimerici administrați intravenos, intra-traheal, intraperitonal etc.

În concluzie, CFRT este o proteină membranară implicată în fibroza chistică, a cărei pliere corectă a domeniilor CFRT pentru o asamblare corectă. Mutațiile proteinei CFRT cauzează simptomatologii în fibroza chistică. Terapiile pentru această maladie sunt realizate în funcție de mutațiile ce au loc la nivelul CFRT. Este nevoie de studiu intens al mecanismelor microbiologice de pliere și asamblare a subunităților implicate în CFRT pentru a realiza terapii eficiente pentru tratarea fibrozei chistice.

Bibliografie

  1. Kim SJ, Skach WR. Mechanisms of CFTR Folding at the Endoplasmic Reticulum. Front Pharmacol. 2012;3:201
  2. Meng X, Clews J, Martin ER, Ciuta AD, Ford RC. The structural basis of cystic fibrosis. Biochem Soc Trans. 2018;46(5):1093‐1098.
  3. Moran O. The gating of the CFTR channel. Cell Mol Life Sci. 2017;74(1):85‐92
  4. Pranke I, Golec A, Hinzpeter A, Edelman A, Sermet-Gaudelus I. Emerging Therapeutic Approaches for Cystic Fibrosis. From Gene Editing to Personalized Medicine. Front Pharmacol. 2019;10:121.

EU e-Privacy Directive

Departamentul de Anatomie, fiziologie animala si biofizica

Prof. dr. Dan Florin Mihailescu (director de  departament)

Prof. dr. Alexandru  Babes

Prof. dr. Speranta Avram

Prof. dr. Violeta Ristoiu

Prof. dr. Beatrice Mihaela Radu

Conf. dr. Mihaela Marcu Lapadat

Conf. dr. Dana Cucu

FP

Conf. dr. Florentina Pluteanu

Lect. dr. Doru Gabor

TS photo

Lect. dr. Tudor Selescu

Lect. dr. Cristina Matanie

Alexandru Deftu

Asist.dr. Alexandru Deftu

roxana

Asist.dr. Roxana Gheorghe

Cornelia Dragomir

Geanina Haralambie

Liliana Stamatin

Cristina

PozaAcademieLuiza

Prof. dr. Maria Luiza Flonta (profesor emerit)