Tehnica de patch-clamp este o tehnică de electrofiziologie ce permite atât măsurarea potențialului de membrană (adică a voltajului de-a lungul membranei), cât și a curenților membranari (adică poate surprinde, din punct de vedere electric, fluxurile de ioni ce intră și ies din celulă, prin proteinele transmembranare, numite și canale ionice).

Tehnica a fost dezvoltată de Erwin Neher și Bert Sakmann în anii 80. Aceștia au plecat de la studiile lui Alan Hodgkin și Andrew Huxley despre potențiale de acțiune. Cei patru au luat Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină, în 1991 și 1963.

Kenneth Cole a fost de fapt primul biofizician care a reușit să obțină niște rezultate folosindu-se de conceptul de voltage clamp, deci a menținut un anumit voltaj pentru a înregistra curenții. El este și cel care a creat primul model electric al pielii. 

Revenind la cei doi cercetători germani, descoperirea lor a făcut posibilă înregistrarea curenților din canale singulare, ceea ce a dus la înțelegerea aprofundată a multor procese fiziologice fundamentale, cum ar fi potențialul de acțiune. Practic, se pot observa, în timp real, modificări ce apar în activitatea unui singur canal ionic, cum ar fi conductanța (rata cu care ionii traversează membrana), viteza de deschidere și închidere a canalelor. În anii ‘90 a avut loc o explozie în cunoaștere, s-au descoperit multe canale noi, activate de voltaj sau de ligand, și s-au sintetizat foarte mulți compuși care să funcționeze ca liganzi pentru canalele ionice.

Elementele componente ale unei instalații de patch-clamp

Avem în primul rând un amplificator, un aparat ce conține circuitele necesare pentru a amplifica și apoi înregistra fără prea mult zgomot de fundal curenții ce străbat membrana prin canalele ionice. De asemenea, acesta poate detecta modificări în potențialul membranar și poate seta menținerea unor anumite voltaje, adică se pot genera protocoale de lucru. Următoarele componente sunt: un digitizer, care convertește semnalele analog ale amplificatorului în semnale digitale, un soft care să centralizeze toate aceste date (pClamp), un headstage sau holder, în care este fixată micropipeta, un microscop inversat, care poate să aibă și o cameră de filmat atașată, un micromanipulator, care manevrează micropipeta foarte fin pentru a ajunge în zona de interes, o cușcă Faraday, folosită pentru a bloca câmpurile electromagnetice externe și alte zgomote de fundal, și o masă antivibrații pentru a ține preparatul fix pe toată perioada înregistrărilor.

Celulele sunt plasate în vas, complet imersate în soluție salină sau soluție Ringer. Poate să existe și un sistem de perfuzare care să introducă în vas un flux continuu de Ringer sau diferiți compuși farmacologici. Sunt folosiți doi electrozi, confecționați din argint sau alte materiale, clorurați cu clorură de argint. Primul electrod este plasat în baie (electrodul de referință) și este imersat direct în soluția Ringer sau intră în contact cu soluția printr-o punte de agar. Avem și o pipetă din sticlă borosilicată care are în interior un al doilea electrod și o soluție salină asemănătoare cu cea intracelulară sau nu, în funcție de experiment. Experimentatorul apropie pipeta de membrana celulei printr-un microsistem de manipulare pe toate cele trei axe și, la un moment dat, stabilește un contact între vârful micropipetei și membrana celulară. Se aplică o presiune negativă printr-un sistem de tuburi și astfel se formează configurația gigaseal. Se numește așa din cauza rezistenței electrice formate între pipetă și membrană, care ajunge la valori de ordinul gigaohmilor.

 În timpul experimentelor de Voltage clamp, un curent este injectat continuu în sistem prin amplificator astfel încât voltajul măsurat să fie menținut egal cu cel comandat în amplificator. Electrodul de înregistrare are două roluri, pe de o parte măsoară constant voltajul și, pe de altă parte injectează un curent pentru a modifica acel voltaj până la valoare setată pe amplificator, astfel putând fi create foarte multe protocoale de voltaj.

Există mai multe tipuri de configurații de patch-clamp. Odată aplicată presiunea negativă și celula intrată în gigaseal se poate intra în configurația whole-cell sau outside-aut, dacă se rupe membrana. Dacă nu este ruptă membrana, se poate intra în configurația inside-out. Sunt foarte întâlnite experimentele în configurația whole-cell pentru că permit vizualizarea curenților de pe toată suprafața membranei.

Patch-clamp și Python

Achiziția datelor de patch-clamp se face în programul pClamp și se generează fișiere cu extensia ABF (Axon Binary Format). Aceste fișiere pot fi deschise și prelucrate în pClamp și apoi transformate în coloane foarte lungi de numere, ce reprezintă curenți, voltaje etc. Abia după, aceste coloane pot fi transferate în programe de prelucrare statistică.

Foarte util, în python există o librărie pentru acest lucru. După instalarea acestei librării, se pot deschide direct fișierele ABF care pot fi vizualizate, prelucrate și finisate. Cu doar câteva linii de cod pot fi afișate mai multe înregistrări în paralel, colorate diferit zonele unei trepte de voltaj, și multe alte tipuri de analiză a datelor. Se poate chiar și antrena un program să treacă fișierele nou adăugate direct prin filtrele construite de tine. Programul poate fi găsit pe site-ul lor oficial sau pe GitHUB.

Bibliografie

  1. AJouhanneau, J.-S., & Poulet, J. F. A. (2019). Multiple Two-Photon Targeted Whole-Cell Patch-Clamp Recordings From Monosynaptically Connected Neurons in vivo. Frontiers in Synaptic Neuroscience
  2. Conforti, L. (2012). Patch-Clamp Techniques. Cell Physiology Source Book, 369–381. doi:10.1016/b978-0-12-387738-3.00020-2
  3. Delgado-Ramírez, M., Sánchez-Armass, S., Meza, U., & Rodríguez-Menchaca, A. A. (2018). Regulation of Kv7.2/Kv7.3 channels by cholesterol: Relevance of an optimum plasma membrane cholesterol content. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 1860(5), 1242–1251. doi:10.1016/j.bbamem.2018.02.016
  4.  Hodgkin, A. L., & Huxley, A. F. (1945). Resting and action potentials in single nerve fibres. The Journal of Physiology, 104(2), 176–195. doi:10.1113/jphysiol.1945.sp004114
  5. Kornreich, B. G. (2007). The patch clamp technique: Principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology, 9(1), 25–37.
  6. Malboubi, M., & Jiang, K. (2013). Gigaseal Formation in Patch Clamping: With Applications of Nanotechnology.
  7.  NEHER, E., & SAKMANN, B. (1976). Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature, 260(5554), 799–802. doi:10.1038/260799a0 
  8. Rahman, T., & Taylor, C. W. (2010). Nuclear Patch-Clamp Recording from Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptors. Calcium in Living Cells, 199–224. doi:10.1016/b978-0-12-374841-6.00008-6

EU e-Privacy Directive

Departamentul de Anatomie, fiziologie animala si biofizica

Prof. dr. Dan Florin Mihailescu (director de  departament)

Prof. dr. Alexandru  Babes

Prof. dr. Speranta Avram

Prof. dr. Violeta Ristoiu

Prof. dr. Beatrice Mihaela Radu

Conf. dr. Mihaela Marcu Lapadat

Conf. dr. Dana Cucu

FP

Conf. dr. Florentina Pluteanu

Lect. dr. Doru Gabor

TS photo

Lect. dr. Tudor Selescu

Lect. dr. Cristina Matanie

Alexandru Deftu

Asist.dr. Alexandru Deftu

roxana

Asist.dr. Roxana Gheorghe

Cornelia Dragomir

Geanina Haralambie

Liliana Stamatin

Cristina

PozaAcademieLuiza

Prof. dr. Maria Luiza Flonta (profesor emerit)