Vom examina caracteristicile cancerului. Aceste semne distinctive sunt proprietăți comune tuturor cancerelor.
Prima caracteristică a celulelor tumorale este imortalitatea replicativă. Celulele umane normale au o capacitate finită de a se divide prin mitoze ceea ce se definește ca replicare finală. Acest lucru se datorează în mare parte în parte telomerilor cromozomilor, care reprezintă regiuni de ADN repetitiv de la capetele cromozomilor și care devin mai scurte după fiecare diviziune mitotică. Unul dintre primii savanți care au observat acest lucru a fost Dr. Lenit Hayflick. Când celulele se opresc din diviziune, se știe că au atins limita lui Hayflick. Iar odată ce celulele ajung la limita lui Hayflick, nu mai pot diviza și intră în faza G0 a ciclului celular similară și senescenței celulară. Pentru a întelege acest proces este nevoie de descrierea ciclului celular.
Organismele vii sunt compuse din celule, a căror creştere şi diviziune necesită succesiunea programată a unor evenimente şi procese care formează ciclul celular. Unele din aceste procese sunt continue, ca de exemplu sinteza proteinelor sau a lipidelor. Altele, de exemplu sinteza ADN, sunt procese discontinui şi depind de procesul de diviziune celulară. Fiecare ciclu celular cuprinde două perioade dinamice şi calitative distincte: interfaza şi mitoza. Procesul multiplicării celulare are la origine replicarea ADN-ului cromozomial, replicare care are loc în perioada interfazică. Pentru a asigura diviziunea corespunzătoare a celulei, există mai multe mecanisme de control care apar în timpul ciclului celular. Acestea sunt cunoscute sub numele de puncte de control al ciclului celular. Acestea sunt situate în fazele gap sau faza G .
Interfaza ocupă cea mai mare parte din durata ciclului celular (90%), constituie perioada în care celula desfăşoară o susţinută activitate biosintetică (sinteza de ADN, ARN, proteine), asigurând condiţiile necesare realizării diviziunii celulare. În cadrul acestei etape au fost descrise trei perioade distincte:
Perioada presintetică sau postmitotică, se caracterizează prin:
- intensificarea transcripţiei şi a proteosintezei, procese aproape blocate în perioada mitotică;
- decondensarea cromatinei – proces important pentru activarea transcripţiei genelor;
- reorganizarea nucleolilor
- cromozomii sunt monocromatidieni şi se caracterizează prin set diploid (2n = 2c).
În această etapă, cea mai lungă de altfel din întreg cicul celular, are loc sinteza proteinelor și creșterea celulelor, procese care se desfășoară sub influența unor factori externi, în primul rînd a factorilor de creștere. Genele care codifică factorii de creștere sunt protooncogene, doarece supraexpresia acestora este observată în multe tipuri de cancere. La rândul lor factorii de creștere și receptorii lor sunt importanți markeri tumorali și ținte terapeutice promițătoare. În caseta nr. 1 este prezentat receptorul factorului epidermal de creștere, una din proteinele mutante.
Alte semnale externe, în afara de factorii de creștere sunt inhibiția de contact și inhibiția dependentă de ancorare. Inhibiția de contact este procesul prin care celulele își limitează proliferarea o dată ce au atins o anumită limită. Contractul dintre ele vor impune celulelor să crească într-un singur strat (monostrat). Ex vivo (adică în condiții de laborator) celulele cresc pănă ocupă tot substratul pe care îl au la dispoziție. Mai mult, celulele normale aderă la substrat, în timp ce celulele tumorale devin circulante. După ce au depăşit perioada G1, timpul necesar pentru perioada S şi G2, deci până la începutul diviziunii este foarte constant pentru diferite celule. De aceea s-a introdus noţiunea de punct de restricţie (punct R) pentru momentul imediat, urmat de sfârşitul perioadei G1, care trebuie depăşit pentru ca celula să poată parcurge etapele următoare ale ciclului celular. Factorii de creștere au efect în timpul fazei G1 până în R. Punctul de restricție (R) denumit și punctul de angajament al celulei definește un punct critic al fazei G1 dupa care celula este obligată să demareze replicarea ADN și nu mai este sensibilă la factori de creștere. În R celula decide dacă avansează catre diviziunea celulară sau intră în faza G0. Oprirea în faza G0 poate fi reversibilă sau ireversibila (senescența). Din faza G0 o celulă poate ieși în urma activării de către factorii externi. Factori externi importanți sunt factorii de creștere. Unul dintre cei mai bine descriși în procesele de tumorigeneză este HER2 prezentat în caseta numarul 1.
Her2 este codificat de o protooncogenă și este una din țintele terapeutice favorabile în multe tipuri de cancer.
Caseta număryl 1-HER2
HER2 (Human Epidermal Growth Receptor = receptorul factorului de creștere epidermal uman) este o oncoproteină codificată de gena HER2 aflată pe cromozomul 17. Mai mult decât atât, HER2 este un marker tumoral, deoarece este supraexprimată în 25-30% din cazurile de cancer de sân și face parte din familia receptorilor transmebranari de tirozin-kinază din familia EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), denumită familia EGFR care este alcătuită din 4 membri:
- HER1, cu liganzii specifici: EGF, TGF, AMPHIREGULIN, HB-EGF, EPIREGULIN, BETA-CELULLIN
- HER2 – NU ARE LIGANZI
- HER3, cu ligandul specific: HEREGULIN
- HER4, cu liganzii specifici: NRG2, NRG3, HEREGULIN, BETA-CELULLIN
Caracteristici generale ale acestor receptori sunt:
Din punct de vedere structural sunt alcătuiți din 3 domenii:
- Domeniul extracelular
- Domeniul transmembranar
- Domeniul intracelular
HER2 formează homodimeri (HER2-HER2) sau heterodimeri (HER2-HER1/HER3/HER4). Îîmpreună cu factorii de creștere care îi stimulează, joacă un rol important în creșterea celulară și diviziunea celulară (transmiterea semnalelor din afara celulei spre nucelu). Căile de semnalizare prin care exercită aceste efecte sunt:
- Se activează phosphoinositide 3-kinaza (PI3K)
- Pentru a se transmite semnalul PI3K foloseste PIP2 (fosfolipid component al membrane celulare), pe care îl transformă prin fosforilare în phosphatidilinositol trifosfate (PIP3), care activează kinaza 1 dependentă de PDK.
- Phosphoinositide dependent kinase (PDK) fosforilează AKT, care inhibă factorii de transcripție, ducând la supraviețuire celulară
Răspuns imun mediat:
În acest tip de terapie, se folosește Herceptin (Transtuzumab). Acesta este un anticorp monoclonal, care se leagă de domeniul extracelular al lui HER2, blocând astfel căile de semnalizare. Herceptinul stimulează celulele sistemului imunitar (celulele NK), care la rândul lor se leagă specific de acesta, anihilând celula canceroasă.
HERCEPTIN+PACLITAXEL/DOCETAXEL
Paclitaxelul este un tip de medicament care actionează la nivelul microtubulilor. Se leagă de tubulină și inhibă desamblarea microtubulilor, astfel ne mai asigurând componentele necesare formării fusului de diviziune. Într-un final, celulele sunt blocate în faza M a ciclului celular, diviziunea este inhibată, ajungându-se la APOPTOZĂ.
Pertuzumab este un anticorp monoclonal, care inhibă dimerizarea HER2
Inhibarea eliberării HER2
Când este supraexprimar HER2, are loc o scindare proteolitică, urmată de eliberarea domeniului extracelular solubil. Pentru inhibarea scindării și eliberării HER2 se folosește Herceptin.
Inhibarea căii PI3K-PDK-AKT
Pentru inhibarea acestei căi, se acționează cu Herceptin, care scade fosforilarea, inhibând în final diviziunea celulară și inducând apoptoza.
Inhibarea angiogenezei
Când este supraexprimar HER2 se observă și o rată mare a angiogenezei.
Se administrează Herceptin și Paclitaxel care au ca efect reducerea producției factorului de creștere endotelial vascular
Arestul în faza G1 a ciclului celular se face tot prin administrarea de Herceptin, care are ca efect, în final, stoparea proliferării celulare
Când apare rezistența la Herceptin, se folosește Nertinib (-ib=moleculă mică), care acționează asupra lui HER2 astfel:
- Reduce autofosforilarea, prin țintirea reziduului de cisteină
- Inhibă semnalul de transducție și a căilor de reglare a ciclului celular
- Blochează celulele în faza G1 a ciclului celular
Sinteza ADN/ului decurge numai în faza S a ciclului celular al eucariotelor. Unul din factorii care influenţează sinteza ADN-ului este timpul necesar celulei pentru a se divide. În această etapă replicarea ADN-ului este în majoritatea cazurilor bidirectională. Câteva mecanisme de sinteză a ADN-ului (creştere a lanţului) permit replicarea semiconservativă:
1) Un lanţ creşte dintr-un punct, numit origine de replicare (ori 1), iar celalalt lanţ este sintetizat dintr-un alt punct (ori 2). Acest mecanism apare în cazul ADN-ului liniar viral (adenovirus);
2) Existenţa unei singure furci de replicare (regiunea în care catenele parentale sunt separate şi servesc ca matriţă) şi a unui singure origini;
3) Sinteza poate porni dintr-un singur punct şi se desfăşoara în ambele direcţii, bidirecţional, fiecare lanţ fiind copiat în cadrul unei furci replicative. Datele din literatură vin în sprijinul ultimului mecanism. Iniţierea şi propagarea lanţului de ADN la nivelul furcilor de replicare ADN-ul duplex este un helix antiparalel (cele doua lanţuri sunt opuse 3’-5’ respectiv 5’-3’ şi au polarităţi diferite). Toate polimerazele catalizează adăugarea nucleotidelor la capatul 3’ al lanţului părinte, iar lanţul nou format creşte în direcţia 5’®3’. Mai mult toate polimerazele descoperite până în prezent continuă secvenţa de noi polinucleotide pornind de la o secvenţă de ADN sau ARN preexistentă. ADN-ul dublu catenar este desfăcut de către proteina de iniţiere, helicaza, în regiunile numite origini de replicare (OriC). Aceste regiuni se caracterizează prîntr-o secvenţă specială de nucleotide, reprezentată de perechi de baze A-T. Aceste perechi nucleotidice sunt mai uşor de clivat, deoarece ele conţin mai puţine legături de hidrogen, faţă de perechile G-C. Ori C este recunoscuta şi de către proteina dnaA. Proteina dnaA recunoaşte şi denaturează ADN-ul într-o regiune de 13 nucleotide în principal baze A sau T. Această etapă este asistată şi de proteina HU. La această regiune se leagă proteina dnaB (helicaza), proces asistat de o altă proteina dnaC (această proteină ajută la împachetarea adecvată a proteinei dnaB pe furca de replicare). Din fiecare origine de replicare pleacă două furci de replicare care se îndepărtează de locul de origine, desfăcând dublul helix de ADN pe măsură ce înaintează. Deci, replicarea ADN-ului în cromosomii procariotelor şi eucariotelor este bidirecţională. După legarea helicazei, o nouă proteină, SSB (single-stranded DNA binding) stabilizează ADN-ul monocatenar din bucla de replicare. Primozomul, un complex de proteine ( format din dnaB, dnaC, primaza şi alte proteine), constituie elementul cheie al iniţierii. Acest complex se deplasează simultan cu furca de replicare (consumând ATP-ul) şi este responsabil pentru sinteza unu i segment de ARN necesar replicării lanţului. La nivelul furcii se află dispozitivul de replicare reprezentat de ADN-polimeraza, enzimă care catalizează ataşarea de deoxiribonucleotide la capătul 3 al segmentului de ARN iniţial, ulterior la capatul 3’ al lanţului de ADN în creştere. ADN-polimeraza nu se disociază de ADN ori de câte ori adaugă un nou nucleotid pe lanţul de ADN în creştere, dimpotrivă, ea rămâne ataşată pe ADN şi se mişcă pas cu pas de-a lungul lui timp de mai multe cicluri ale reacţiei de polimerizare. Deoarece, cele două catene ale dublului helixului sunt orientate în direcţii opuse, furca de replicare este asimetrică. Astfel, una dintre noile catene de ADN este sintetizată pe o matriţă parentală 3'-5', iar cealată catenă este sintetizată pe o matriţă parentală 5'-3'. ADN-polimeraza poate cataliza creşterea catenei noi numai în direcţia 5' -3', întrucât adaugă noi nucleotide numai la capătul 3'al catenei parentale. Imediat după ce replicarea s-a declanşat s-a introdus în mediu timidină marcată cu tritriu. S-a constatat apariţia temporară la nivelul furcii replicative a unor fragmente scurte de ADN, lungi de 1000-2000 de nucleotide, denumite fragmente Okazaki. Fragmentele Okazaki sunt sintetizate, discontinuu, în direcţie opusă sintezei catenei prioritare (în ceea ce priveşte modul de ataşare al nucleotidelor acesta este identic), şi mai târziu alipite prin intermediul ADN-ligazei, pentru a forma o catenă nouă, neîntreruptă de ADN. inteza catenei întârziate se realizează întotdeauna în urma sintezei catenei prioritare, întrucât fragmentele Okazaki rezultă numai după ce furca replicativă s-a desfăcut cu un număr de nucleotide egal cu lungimea acestor fragmente. Replizomul este un amsamblu de proteine care include enzimele şi factorii necesari replicării ADN-ului. Acest complex este responsabil pentru sinteza a două catene noi de ADN. ADN polimerazele ADN polimerazele au fost descoper ite în extractele celulare datorită capacităţii lor de a încorpora deoxinucleotide în ADN, utilizând trifosfaţii deoxinucleozidelor drept substrat. Aceste enzime copie numai o matriţă de ADN preexistentă şi împerecherea bazelor din noului lanţ sintetizat cu cele din lanţul părinte se face după aceleaşi reguli postulate de Watson şi Crick. Iniţial ADN polimeraza a fost purificată din Ecoli şi mai târziu din alte microorganisme. În toate cazurile s-a constatat faptul că enzima are nevoie de un segment de start care posedă un capăt 3’-OH liber. Trei ADN polimeraze (I, II și III) au fost purificate din Ecoli. Deoarece bacteriile în care existau o mutaţie specifică pentru polimeraza III, mutaţie sensibilă la temperatura, încetau să mai producă ADN la temperaturi mai mici s-a acordat o atenţie deosebită acestei enzime, încercându-se să se obţină furci de replicare în vitro. ADN polimeraza I este importantă în corectarea erorilor care apar în procesul de copiere al ADN-ului. Polimeraza de tip II joacă un rol în repararea ADN-ului în situaţia în care acesta a suferit denaturări fizice sau chimice. Odata ce polimeraza III este ataşată la ADN-ul matrită este dificilă desprinderea enzimei, în timp ce polimerazele I şi II se detaşeaza de pe ADN-ul matriţă după adaugarea unui segment de oligonucleotide. Polimeraza III împreună cu ceilalţi factori de replicare poate sintetiza ADN în vitro la aproximativ 500 pb/secundă. Ambele polimeraze (I şi III) posedă activitate exonucleazică (ADN polimeraza I îndepărtează resturile de segment ARN). ADN polimerazele adaugă nucleotidele cu o eroare de 1 la 10000. Datorită activităţii exonucleazice, ambele enzime pot îndepărta nucleotidele “greşite” şi după aceea să adauge nucleotidele corespunzătoare. În acest fel frecvenţa de apariţie a unuei erori este de o nucleotidă într-un milio
care se caracterizează prin:
- transcripţia şi sinteza proteinelor cu aceeaşi intensitate ca şi în G1, asigurându-se condiţiile necesare intrării celulei în mitoză.
La desfășurarea ciclului celular participă două tipuri diferite de proteine, și anume, ciclinele și kinazele dependente de cicline (cdk), care prin procese de asamblare, formează diferite complexe de tipul ciclină – cdk, care au rolul de a-și pune în funcțiune activitatea lor catalitică, așa cum se observă și în figura 1.
Figura 1:Proteina RB și rolul său în desfășurarea ciclului celular Rb – în stare nefosforilată, Rb – P reprezintă proteina RB în stare fosforilată, sunt cele 2 forme ale proteinei retinoblastoma. În fazele G0 și G1, Rb intervine în stare cuplată cu E2F determinând blocarea situsurilor sale de transactivare. În faza G1, Rb suferă un process de fosforilare și ulterior, îl eliberează pe E2F. Drept urmare, sunt exprimate genele codificatoare ale factorilor răspunzători de inițierea și de desfășurarea fazei S. |
Unul dintre punctele de restricție ce apar de-a lungul fazelor ciclului celular este punctul de control G1/S. La acest nivel se iau decizii despre modul în care vor progresa celulele care trebuie să continue runda de diviziune celulară, dar și cum se pot retrage anumiți mitogeni exogeni de la acest nivel.
În comparație cu celelalte cicline, ciclinele de tip D (D1, D2 și D3), care au rolul de a interveni în reglarea ansamblului CDK 4/6, converg o serie de căi de semnalizare precum MAPKs, STATs, PI3K/AKT, wnt / b - catenina, dar și unii hormoni steroizi. Prin intermediul acestei căi se asigură și postreglarea acestei proteine. Pe lângă alte gene, factorii din familia E2f sunt responsabili și de reglarea ciclinelor A și E, la care se atașează CDK2. Rolul complexului ciclina E/ CDK2 este de a menține fosforilarea proteinei RB în parcurgerea fazelor ciclului celular de către celule.
Modificări ale ADN pot apărea datorită condițiilor de stres.
Repararea moleculei ADN înainte ca acesta să fie replicat poate avea loc datorită blocării ciclului celular. La acest nivel acționează p21, care este clasic definit, inhibitor al activității CDK. Acesta este capabil să promoveze, sau cel puțin, să stabilizeze asamblarea complexului ciclina D/ CDK4-6. Postreglarea lui p53 favorizează expresia lui p21. Expresii alterate (în sensul creșteri ) ale compușilor care mediază ciclul celular ( p 21, p 16), pot apărea ca având implicare în procesul de senescență, unde celulele, deși prezintă o creștere ireversibilă, au o rată mare de supraviețuire, acestea putând conduce la defosforilarea lui RB ( hiperactivitate ) și represia lui E2f.
Aceste evenimente care descriu modul în care RB reglează factorii E2F se pot observa și în cadrul figurii 2.
Figura 2. Etapele reglării factorilor E2F de către proteina RB |
Rolul căii RB – E2F în metastaza cancerului de sân
Calea RB – E2F este responsabilă de controlul procesului de replicare a ADN, dar și de tranziția fazelor G1-S a ciclului celular. Procese precum proliferarea, diferențierea, dar și supraviețuirea celulelor sunt controlate de către proteina RB, rol important prezentând RB1, care datorită faptului că își pierde funcția, are loc inițierea procesului cancerigen.
Witkiewicz și colaboratorii au remarcat, în urma unor cercetări în care au utilizat linia de celule canceroase MCF10A, faptul că moleculele necesare organizării corecte a celulelor, dar și procesului de adeziune dintre celule, suferă modificări în condițiile în care RB1 își pierde activitatea, concomitant cu supraexprimarea lui ErbB2. Și în cazul probelor DCIS s-au remarcat astfel de observații, pierderea activității lui RB1 fiind asociată cu stimularea procesului de invazie.
După ce s-au analizat căile care se activează în cursul dezvoltării tumorilor mamare induse de oncogenele Myc , s-a pus accent pe funcția lui E2F și s-a constatat că inițierea procesului de dezvoltare a tumorii este întârziată atunci când sunt inhibate funcțiile factorilor de transcriere E2f2 și E2f3, constantându-se astfel, creșterea perioadei de supraviețuire fără vreo posibilă recidivă.
J. Nevins susține că E2f1 dobândește un posibil rol de inductor al apoptozei și că nu există nicio legatură între acesta și cancerul uman, E2f3 are un rol deosebit de important în controlul proliferării celulelor, iar E2f4, în diferențierea celulară. Într-o altă serie de studii efectuate la nivel pulmonar, prin comparație cu metastazele pulmonare a fost identificat un factor care are rolul de a media, atât migrarea cât și colonizarea celulară la nivelul plămânului, și anume PTPRD.
Prin cuplare cu E2f2, acest mediator determină amplificarea metastazelor în cancerul de sân, chiar dacă E2f2 întârzie formarea unei tumori. Conform observațiilor lui Trikha și a colab. Săi, E2f3 care posedă un rol important de factor de transcriere la nivelul macrofagelor tumorale (TAM), influențează micromediul metastazelor celulelor tumorale. În lipsa activității sale, apar modificări la nivelul citoscheletului, dar și în procesele de adeziune și migrare celulară, analiza acestuia fiind importantă pentru a se determina gradul de supraviețuire a receptorilor de estrogen (ER), în cazul pacienților cu cancer de sân pozitiv.
Figura 3. Fazele ciclului celular cu indicarea punctelor de control descrise până în prezent. |
Fosforilarea proteinelor din lamina nucleară induce dezasamblarea învelişului nuclear, pe când fosforilarea histonelor H1 produce condensarea cromozomilor, fenomen caracteristic mitozei.
În figura 3 este prezentat ciclul celular și punctele de restricție ale acestuia.
Foarte importante sunt două proteine codificate de gene supresoare de tumori: proteina retinoblastomului (Rb) și proteina p53 prezentate pe scurt în casetele 2 și 3.
Caseta 2-Proteina Rb-
Proteina supresoare Rb, joacă un rol major în reglarea progresiei ciclului celular. Funcționarea corectă a Rb este esențială pentru tranziția G1/S și inactivarea Rb contribuie la dereglarea proliferării celulare.
Rb își exercita funcțiile reglatorii ale ciclului celular prin țintirea familiei de proteine E2F ca factor de transcripție suprimând prin acesta procesul de transcripție. În cadrul ciclului celular factorii de creștere stimulează faza G1 și ajută celula în timpul acestei faze. Însă, aceștia sunt importanți până la un anumit nivel, când celula devine independentă de factorii de creștere și anume în punctul de restricție R. La nivelul acestiu punct de restricție se decide dacă celula este pregatita pentru a trece în faza S sau nu. În absența semnalelor mitotice E2F se leaga de Rb, prin urmare ramane inactiv și nu se mai face trecerea din faza G1 în faza S. Enzima histon deacetilaza se leaga la complexul format de E2F și Rb, astfel ADN-ul devine compact cu nucleozomii bine legati ceea ce face ca trascriptia sa fie greu de realizat. Trecerea în faza S se face în momentul în care E2F este activ și se leaga la genele necesare sintetizarii ADN. Legarea este sustinuta de histon-acetilaza, care induce eliberarea nucleozomilor care permit transcriptia, decondesand ADN-ul.
S-a stabilit ca inactivarea RB prin fosforilare, mutație sau prin interactiunea cu oncoproteinelor virale duce la activarea E2F, facilitand-se astfel progresia ciclului celular.
Mediată de Rb oprirea activitatii E2F implica recrutarea unei varietăti de co-represori ai trascripției și proteine de remodelare a cromatinei, incluzând histon deacetilaza, ADN metil transferaza și proteina Brg/Brm cu rol de remodelare a cromatinei. Inactivarea Rb prin fosforilare secvențială în timpul desfasurarii cilcului celular duce la disocierea acestor co-represori de Rb, facilitând trasncripția. În concluzie, pe parcursul progresiei normale a ciclului celular, Rb este inactivată prîntr-o cascadă de evenimente ale fosforilarii ducând la disocierea proteinelor asociate cu Rb. Aceste evenimente de fosforilare sunt bine reglate intr-un mod dependent de semnal printr-un mecanism care cuprinde cilinele, kinazle dependente de ciline și inhibitorii de cilin kinaze dependente.
Caseta 3-Proteina p53
P53 a fost decoperita in 1979, catalogata initial ca o oncogena, iar ulterior s-a stabilita a fi un puternic supresor tumoral cu aplicabilitate clinica. Exista o lista mare de functii efectoare ale p53. Astfel prin studiul molecular al cailor de semnalizare promovate de p53, s-au stabilit conexiuni neasteptate intre semnalizarea p53 si diverse procese biologice, cum ar fi: metabolismul, repararea ADN-ului degradat, longevitatea, autofagia, necroza, apoptoza, angiogeneza si invazia celulelor tumorale. In aceste studii trebuie sa se tina cont de modificarea si localizarea proteinei p53, de obiectivele sale de activare si represare, de fondul genetic al celulei dar si de mediul extracelular.
Ca raspuns la diferiti factori de stres, celulele pot fi supuse opririi cresterii pentru a impiedica propagarea ADN-ului mutant. P53 induce oprirea ciclului celular în G1 în primul rand prin transactivarea p21, un inhibitor de kinaze dependente de ciclina. În urma cercetarilor din ultimele decenii s-a identificat ca p53 este un factor transcriptional multifuncțional ce regleaza expreia a peste 2500 de gene. P53 intervine în mai multe procese celulare cum ar fi mentinerea stabilitatii genomului, metabolism, longevitate, și reprezinta unul dintre cei mai importanti supresori tumorali. Activata de diversi factori de stres, p53 blocheaza progresia cancerului prin oprirea tranzitorie sau permanenta a ciclului celular, pentru a permite repararea ADN-ului sau pentru a promova apoptoza. P53 este inactiva în 50% din cancere, de aceea se urmareste dezvoltarea de medicamente pentru activarea p53 în tumori. În aceasta lucrare sunt prezentate structura proteinei, funcția acesteia, și strategii actuale pentru a restabili funcția de supresor tumoral, cum ar fi transferul de gene adenoviral, și molecule mici care activeaza p53 sau inactiveaza inhibitorii lui p53. Din momentul in care s-a stabilit a fi un puternic superesor tumoral, au inceput sa apara in practica clinica diverse terapii cu un potential impact asupra pacientilor diagnosticati cu cancer.
Cea mai frecventă cale de terapie țintită este cea care utilizează anticorpi specifici pentru receptori ai factorilor de creștere. Fiind exprimați la suprafața membranei celulare, acești receptori sunt mai accesibili unei terapii celulare. Ca urmare există o serie de compuși de sinteza care țintesc receptorul EGFR (herceptina, descrisă anterior), compuși care blochează intreaga cale de semnalizare a acestor receptori.
Terapiile care țintesc faza S a ciclului celular sunt terapii clasice cu efecte citostatice. De exemplu, există clase de inhibitori de topoizomeraze, enzime cu proprietatea de a desface dublul helix de ADN în faza de sinteză. Irinotecanul este derivat sintetic din aceasta clasă. Acestea sunt prezentate în tabelul nr.1.
Tabelul nr. 1 Inhibitori de topoizomeraze și aplicațiile lor terapeutice |
||
Medicamentul |
Mecanismul de acțiune |
Aplicații terapeutice |
Camptotecină |
Alcaloid citostatic care inhiba legarea TOPO-I de ADN. Toxica sunt folositi derivati intetici |
Cancer de colon, ovarian, cancer gastric, leucemie |
Etopozide |
Inhiba legarea TOPO-i de ADN, Compus citotoxic |
Cancer testicular, gastric de plamani. Leucemii și sarcoame |
Doxorubicină (Dox) |
Grupul antracilinelor derivate dîntr-o specie de Streptomices. Se insereaza în ADN blocand legarea TOPO. |
Carcinoame, Limfom, Sarcomul Hodgkin‘si non-Hodgkin‘. |
Altă clasă de medicamente citostatice este a celor care inhibă ADN polimeraza, enzime care intervin în duplicarea helixului ADN. 5-Fluro-uracilul este compusul cel mai utilizat în tratamente. Grupul agenților care blochează mitoza este împărțit în trei clase principale și anume:
1.) Taxani; includ: paclitaxel and docetaxel.
2.) Alcaloizi din Vinca; includ: vincristina, vinblastina, vindesina, and vinorelbina.
3.) Colchicine.
Compușii care fac parte din aceste clase blochează microtubulii și ca urmare fusul de diviziune și divizunea mitotică. Din grupul taxanilor cel mai cunoscut este paclitaxelul care a fost izolat din coniferul Taxus brevifolia și este comercializat sub numele de Taxol. Este utilizat în cancer de sân, cancer mamar, cancer de plămân.
Alcaloizii de Vinca au ca efect arestul în metastaza.Celulele intra în apoptoza. Alcaloiziii sunt derivati dîntr-o planta din Madagascan denumită Vinca rosea, care parea utila în tratamentul diabetului. Studiul acestui efect a dus la izolarea vinblastinei. Primele observatii despre proprietatile anticancerigene ale vinblastinei au fost observate în laborator în 1962 prin remarcarea regresiei leucemiei la soareci. Cativa ani mai tarziu purificarea alcaloizilor a dus la formarea altor dimeri: vincristina, vinorelbina, vinrosidina. Toate aceste medicamente care țintesc ciclul celular sunt extrem de toxice și dau numeroase efecte secundare. Cea mai mare problemă a terapiei cu citostatice este însă rezistența la tratament. Datorită unor proteine membranare denumite pompe ATP-azice care încep să se supraexprime pe măsură ce se aplică terapia, medicamentele sunt pompate din interiorul celulei. De aceea se încearcă sinteza unor medicamente care să țintească o anumită cale de semnalizare și să poată fi aplicate în concentrații scăzute.
În celulele normale se oprește secvența diviziunilor celulare odată ce telomerele devin prea scurte. Cu toate acestea, un semn distinctiv al celulelor tumorale este că ele sunt în măsură să depășească foarte mult limita lui Hayflick și continuă să intre în faza de mitoză. Depășirea limitei lui Hayflick se realizează prin utilizarea unei enzime denumită telomerază. Telomeraza este capabilă să alungească telomerele atunci când sunt prea scurte pentru a susține proliferarea și este supraexprimată în mai multe tipuri de cancer. Prin faptul că celulele canceroase sunt imortale, sunt capabile să prolifereze continuu și de asemenea, ele pot transmite celulelor fiice gene mutante.
Acestă proprietate conduce la caracteristica numarul doi a cancerului cunoscută ca instabilitate genomica.
Celulele eucariote normale au în nucleu 22 autozomi și o pereche de cromozomi sexuali. Dacă o celulă normală supusă sintezei ADN în timpul ciclului celular detectează o mutație care apare în fazele gap-ului ciclului celular este capabilă să oprească ciclul celular, să repare mutația apoi reintră ciclul celular. Genele implicate în stoparea ciclului celular când sunt detectate mutații sunt cunoscute sub numele de gene supresoare tumorale.
Proiectul Human Genome (HGP) este un proiect international cu scopul de a determina secvența perechilor de baze care formeaza ADN-ul și de a mapa cele aproximativ 20 000–25 000 de gene ale genomului uman. HGP a fost completat a identificat toate bazele azotate din genomul uman și a scos în evidenta existența a aproximativ 30 000 de gene. În urma desfășurării acestui proiect s-a descoperit ca genomul uman conține 3164,7 milioane de baze azotate (A, C, T, and G). Numărul total de gene este de 30 000, dar mai puțin de 2% din genom codifică proteine. Mai mult decât atât, funcțiile a mai bine de 50% din genele descrise nu se cunosc. Tot în urma completării genomului uman s-a descoperit ca aproape (99.9%) nucleotidele sunt identice la oameni. Cromozomii au și multe alte regiuni necodificate localizate în afara genelor. Acestea contin secvențe repetitive implicate în reglarea expresiei genelor iar altele care actioneaza doar ca spatiatori.
Dublu helix (doua lanturi) antiparalele
Structura sub forma de “scara”
Structura este compusa din:
o purinica (adenina și guanina)
o pirimidinica (citozina și timina)
Genele reprezintă o secvență de nucleotide reprezentand unitatea ereditatii.
Totalitatea genelor care codifică informația se numește genotip. Fenotipul reprezintă trasăturile unui organism, și este de fapt rezultatul interacțiunii dintre expresia genelor și mediul înconjrator.
În cancer, atât genotipul cat și fenotipul se modifica permanent.
Figura 4. Fluxul informaţiei genetice |
ADN = acid deoxiribonucleic
ARN = acid ribonucleic
Unităţile de bază (monomerii) = nucleotide, legate între ele prin legături covalente - fosfodiesterice
ADN şi ARN = un fel de polimeri
Deci, ADN şi ARN = structuri polinucleotidice
Componentele de baza dîntr-o gena sunt copiate, dar nu toate informațiile se vor pastra, pentru că într-o genă sunt secvențe de baze codificate dar și secvențe necodificate. Secvențele denumite exoni conțin informațiile care sunt copiate și transmise într-o proteină. Aceste secțiuni sunt conservate în timp ce regiunile denumite introni sunt eliminate și degradate de catre spliceozom. La capatul 5' al fiecarei gene se gasește promotorul, o secvența necesara pentru initierea sau stoparea transcriptiei. Mai departe sunt situate regiunile on și off sau regiunile de activare care determina activarea unei gene. Înainte ca mARN sa iasa din nucleu are loc procesarea lui. Regiunile neimplicate în constructia proteinelor, denumite introni sunt taiate, astfel incat ARN-ul matur ajunge la ribozomi continand numai exonii. Procesul de constructie a exonilor se numeste translatie. Translatia perechilor de baze din ADN în proteine depinde de tripleta de nucleotide din ARNm. Fiecare triplet de nucleotide denumit codon codifica un singur aminoacid și în final un lant de aminoacizi codifica proteinele.Din moment ce ADN-ul are numai 4 perechi de baze într-o gena sunt 64 de combinatii sunt posibile pentru codificarea a 20 aminoacizi. Ca urmarea codul este redundant. Sunt 60 de tripleti pentru 19 aa, 3 tripleti pentru stop, 1 triplet pentru metionina al 20-lea aa care semnalizeaza ”start”. Ca urmare un amonoacid este codificat de mai mult de un triplet. Cand o gena este activata ea determina formarea unei proteine. Acest proces incepe prin alcatuirea unei molecule intermediare denumite ARNm. Pentru trasnferarea informației de la ADN la ARNm este utilizata imperecherea bazelor azotate. O Adenina din ADN se imperecheaza cu un uracil din ARNm. ARNmesager traverseaza nucleul și ajunge în citoplasma la ribozomi, care ii asambleaza în proteine. Genele exista în mai multe varietati denumite alele, unele mai dominanate decat altele.
Cand o genă conține o mutație este foarte probabil ca proteină codificată de această mutație să fie anormală. Uneori este posibil ca proteina să funcționeze normal, dar imperfect. În alte cazuri proteina va fi în totalitate inactivată.
Toate mutațiile reprezintă modificări ale secvenței de bază a aminoacizilor. Aceste mutații pot aparea atât în regiunile codificatoare cât și în cele care nu codifică. Ca urmare, mutațiile apărute în zona intronilor sunt silențioase fiindcă ele nu codifică proteine. Dar până și modificările din zonele de codificare pot fi silențioase datorită redundanței codului genetic. Mutațiile pot implica o modificare a unei singure perechi de baze sau pot implica regiuni mai mari. Cele mai multe din cazurile de cancer se datorează mutațiilor genetice care se acumulează în celulele corpului în timpul vietii. Acestea se numesc mutații somatice, iar genele implicate sunt localizate în autozomi (cromozomi nesexuali). Cancerul poate fi datorat și unor mutații în cromozomii sexuali din ovule sau spermatozoizi. mutațiile liniilor germinale pot aparea de nuovo (pentru prima dată) sau pot fi moștenite de la părinti. Fiecare copil din acestă familie are 50% șansa să moștenească alela afectata și implicit maladia. În bolile în care apar mutații în genele susceptibile de a fi implicate în cancer creste susceptibilitatea persoanelor pentru aceasta maladie. Mutația de novo este o mutație noua care apare într-o celula germinala și este transmisă genaratiilor urmatoare. Aceste mutații sunt specifice anumitor tipuri de cancere. De exemplu ratinoblastomul se caracterizeaza prîntr-o mutație la nivelul cromozomului 13, care prezinta o deletie a unei gene ce codifică proteina Rb. Polipoza adenomatoasă familială (PAF) este o afecțiune moștenită în care numeroși polipi adenomatoși se formează în principal din epiteliul intestinului gros. În timp ce acesti polipi sunt inițial tumori benigne, transformarea lor în tumori maligne (cancer de colon) are loc atunci când sunt lăsate netratate. Exită trei variante ale maladiei: PAF și PAF atenuată (inițial numit sindromul adenomului ereditar plat) sunt cauzate de mutații ale genei APC pe cromozomul 5 în timp ce maladia autozomală FAP recesivă (sau polipoza MYH) este cauzata de mutații ale genei MUTYH pe cromozomul 1. Dintre cele trei, FAP în sine este cea mai severă și mai frecventă; cu toate că pentru toate cele trei, rezultatul este apariția de polipi la nivelul colonului și apariția cancerului de colon sunt limitate la peretele colonului și îndepărtarea lor poate reduce foarte mult raspandirea cancerului.
Marea majoritate a cancerelor umane apar ca urmare a acumularii de mutații somatice. mutațiile somatice nu sunt transmise generatiei urmatoare. Dar o viata indelungata ofera terenul pentru aparitia a unui numar suficient de mare de erori. Dîntr-o singura celula cu informația eronata poate aparea o clona. În cursul meiozei, fiecare pereche de cromozomi se copiaza. Omologii sunt atasati în zona centromerului. Inainte de duplicare seturile de omologi se indeparteaza unul de altul și se misca catre capatul opus al celulei, moment în care poate aparea recombinarea. Mai tarziu în meioza are loc o a doua diviziune, un cromozom și omologul sau se despart lasand un numar haploid (N) în fiecare ovul sau spermatozoid. Daca apar mutații în timpul meiozei, ascestea vor fi mutații ale liniei germinale. Impactul acestor mutații depinde de aminoacidul modificat. Daca modificarea are loc la nivelul situsului catalitic al unei proteine sau la nivelul impachetarii ei, rezultatul poate fi sever. mutațiile nonsense sunt acele mutații care schimba un codon normal intr-un stop codon, și rezulta astfel o proteina incompleta. Unele gene implicate în etiologia unor boli (gena CF – pentru CFTR implicat în fibroza chistică; gena FIX – pentru factorul IX implicat în hemofilia B; gena APC – pentru polipomatoza adenomatoasă de colon, ş.a) posedă în secvenţa codantă o serie de repetiţii în tandem ale unui număr mic de nucleotide ce pot fi implicate în “deraparea replicativă„ producând deleţia sau inserţia unităţii repetitive, fapt ce va genera decalarea cadrului de lectură (o mutaţie frameshift).
Mutația frameshift
Cand o gena este copiata, actiunea incepe în nucleu. O secvența ARNm copiaza exact secvența ADN, codificand exact pentru o proteina fara spatii goale intre tripleti. Aceasta serie de tripleti conectati se numeste cadru de citire. O mutație a cadrului de citire apare în urma deletiei sau aditiei unor nucleotide. Aceasta altereaza continutul fiecarui triplet care urmeaza intr-un cadru de citire. Secvenţele necodante intragenice, şi în special intronii, pot fi sediul unor mutaţii (în circa 10-15% din mutaţiile patogenice). Inainte ca ARNm sa paraseasca nucleul, intronii sunt indepartati iar exonii sunt legati unii de altii printr-un proces denumit splicing. Acest proces este controlat de situsuri specifice din introni denumite donor și acceptor. Desi mutațiile din regiunea necodificata sunt în genele silentioase, nu se intalneste intotdeauna aceasta situatie. Unele dintre cele mai importante regiuni regulatoare sunt în regiunea necodificatoare 5’. Secvența promotorului care regleaza gena se afla acolo. De asemeni secvența care controleaza (enhancer) rata de activitate a genelor se afla în regiuni necodificatoare la distanta considerabila de Gena. Exista și zonele represoare ale genelor. De exemplu proteina Her2 (human epithelial growth factor) este supraexpimata în cancerul de san ca urmare a amplificarii genice în cromozomul 17. Cresterea productiei a moleculelor semnal în cresterea celulara accelereaza rata de progres a cancerului.
Alterarea (prin substituţie) a situsurilor de decupare a intronilor (în engleză – splice site mutațions) – situsul donor (5’-GT) sau acceptor (AG-3’) – face ca excizia să se producă la următorul exon şi, ca atare, în ARNm-ul matur se va încorpora o parte sau întregul intron sau va lipsi un exon (în engleză – exon skipping), în funcţie de situsul afectat. Ambele situaţii au consecinţe importante asupra expresiei genei (ARNm instabil; polipeptid nefuncţional). Ocazional au fost descrise mutaţii patogenice şi în secvenţele 5’UTR (hemofilia B Leyden) sau 3’UTR, transcrise dar netranslate, din primul şi ultimul exon; ele pot modifica rata sintezei proteice. În leucemia mielogena cronica apare o translocatie intre cromozomul 9 și 22. Acest rearanjament al materialului genomic creaza o gena de fuziune denumita Bcr-Abl care produce a proteina tirozin kinaza ce sta la baza dezvoltarii leucemiei. și gena abl codifica o protein kinaza dar cea nou formata pe cromozomul de numit Philadephia este intotdeauna on. Medicamentul Gleevec blocheaza activitatea acestei gene.
Un grup de gene implicate în dezvoltarea cancerului sunt denumite oncogene. În prezenta lor sau activitatea lor exacerbata determina aparitia cancerului. Cand oncogenele se afla în celula normala ofera instructiuni de crestere normala a celulelor; se numesc în acest caz proto-oncogene. Oncogenele cele mai descrise pana acum sunt cele care codifica factori de crestere, receptori ai factorilor de crestere, factori de transcriptie și proteine implicate în reglarea ciclului celular. Genele supresoare tumorale sunt o familie de gene normale care informeaza celula sa produca proteine ce restrictioneaza cresterea și dezvoltarea aberantă a celulelor. Sunt ca o frana a unei masinii. Daca aceste gene sufera mutații este ca și cum frana nu mai funcționeaza corect iar cresterea și dezvoltarea nu mai pot continua. Daca o gena tumorala supresoara este mutanta sau inactiva poate determina aparitia cancerului. Cei cu risc crescut de aparite a cancerului au de regula o copie defectoasa a unei gene supresoare. Cum genele vin în pereche de la ambii parinti existenta uneia nu duce obligatoriu la cancer. Dar daca copia a doua este supusa unei mutați creste riscul de cancer.
Testul genetic presupune examinarea ADN-ului unei persoane - de obicei din celule prelevate dntr-o probă de sânge-pentru mutații legate de un tip de cancer. Unele teste genetice pot identifica schimbari în intregul cromozom. Alții examinează porțiuni scurte de ADN din cadrul genelor. Totuși, alții caută proteinele codificate de genele presupuse a fi defecte. Testele genetice servesc mai multor scopuri. Ele sunt utilizate pe scara larga pentru screeningul nou-nascutilor pentru o varietate de boli. Adesea, aceste informații permit medicilor să minimizeze problemele cauzate de mutație. În oncologie, medicii se folosesc de testare pentru a diagnostica genele implicate în cancer, pentru a clasifica cancer în subtipuri, sau pentru a prezice capacitatea de reacție a unui pacient la tratamente noi. Oamenii de știință care caută boli determinate de modificări genetice adesea încep prin studierea probelor recoltate de ADN din "familii predispuse", în care numeroase rude, pe parcursul mai multor generații, s-a dezvoltat maladia respectivă. Terapiile care pot fi utilizate pentru corectarea expresiei sau chiar a mutațiilor apărute într-o genă sunt în mare măsură la nivel experimental. Cu toate acestea, cel puțin una dintre ele și anume terapia genică de substituție este aplicată cu succes.
Avansările în biotehnologie au adus terapia genică în fruntea cercetării medicale. De-a lungul timpului, au fost dezvoltate metode sigure de a transfera și exprima diferite gene la nivelul celulelor țintă, utilizând vectori virali. Astfel, au apărut două abordări principale: modificare in-vivo și cea ex-vivo, pentru care, cele mai potrivite organisme celulare sunt retrovirusurile si adenovirusurile. Vectorii non-virali sunt mult mai puțin eficienți decât cei virali, dar prezintă anumite avantaje datorită imunogenității și a marii lor capacități în terapie.
Considerate a fi forme simple de viață, virusurile servesc ca vectori naturali înalt dezvoltați pentru transferul de informație genetică în interiorul celulelor. Această atribuție a lor a dus la încercarea folosirii vectorilor virali recombinați pentru eliberarea de gene terapeutice în diferite țesuturi afectate.
Terapia genică umană este o disciplină inovativă, fiind un adaugare efficienta adusa numeroaselor abordări în cazul afecțiunilor de la nivelul organismului uman. Aceasta promite să schimbe practica în medicină, prin tratarea cauzei afecțiunii și nu a simptomelor acesteia.
Vectorii adenovirali au asigurat un sistem potrivit pentru studiile asupra exprimării genelor și a aplicațiilor terapeutice. Experimentele recente în dezvoltarea vectorilor adenovirali s-au axat pe tropismul virusurilor, acomodarea la gene de dimensiuni mai mari, creșterea stabilității și a controlului expresiei genelor.
Terapia genică ce utilizează vectori adenovirali se află într-un stadiu de început, iar toate studiile efectuate se bazează pe experimente, scopul fiind siguranța și eficacitatea procedurilor.
Există două tipuri de terapie genică:
1) Terapia liniei germinale
2) Terapia genică a liniei somatice
În acest caz, gameții sunt modificați prin introducerea în genomul lor a unor gene funcționale. Astfel, modificările datorate terapiei genice vor putea fi transmise și generațiilor viitoare.
Terapia genică a celulei somatice
Terapia de substitutie
Aceasta constă în izolarea celulelor din țesutul afectat, în care va fi introdus un vector. Acesta conține gena sănătoasă și va pătrunde în nucleul celulei, pentru a înlocui gena disfuncțională. Următorul pas este ca celulele corectate să fie introduse în pacient. Nicio modificare sau efect al acestei terapii nu va putea fi transmis generațiilor următoare.
Anumite virusuri sunt utilizate ca vectori, deoarece acestea pot livra noua genă prin infectarea celulei afectate. Unele tipuri de virusuri, cum ar fi retrovirusurile, își integrează materialul genetic (inclusiv noua genă) într-un cromozom în celula umană. Spre deosebire de acestea, adenovirusurile introduc ADN-ul lor în nucleul celulei, acesta nefiind integrat într-un cromozom.
Vectorul poate fi introdus prin injectare sau prin intermediul perfuziilor direct într-un țesut specific al corpului, de unde este luat de către celule individuale. Acest lucru se poate face și în laborator, luând celule de la pacient și punându-le în contact cu vectorul. Următorul pas este introducerea celulelor care conțin vectorul în organismul pacientului. În acest fel, dacă tratamentul dă roade, noua genă, eliberată de către vector, va fabrica o nouă proteină funcțională.
Un vector ideal trebuie să fie foarte specific, capabil să livreze eficient una sau mai multe gene. Acesta nu trebuie să fie recunoscut de sistemul imunitar al gazdei. În acest sens, odată introdus în organismul pacientului, vectorul nu are voie să declanșeze o reacție alergică sau o inflamație. Un alt aspect important este acela că vectorul trebuie să fie capabil să exprime acea genă atâta timp cât este necesar, în general toată viața pacientului.
Sunt folosite două tehnici de introducere a vectorului în organismul pacientului:
- Tehnica in-vivo.
- Tehnica ex-vivo
Cea mai utilizată tehnica in vivo, care folosește celule extrase de la pacient. În prima etapă genele normale sunt extrase și clonate. În continuare, celulele afectate luate de la pacient sunt puse în contact cu vectorii. Iar în final, celulele corectate sunt reintroduse în corpul pacientului pentru a produce proteine funcționale, care să lupte împotriva bolii respective (fig. 4).
În cazul tehnicii ex-vivo, nu sunt folosite celule preluate de la pacient. Acestuia i se administrează vectori care conțin gena normală, pe cale intravenoasă. Aceștia se vor îndrepta către țesutul/celululele țintă (fig. 1).
Figura 5. Tehnica ex-vivo și tehnica in-vivo
Virusurile sunt cel mai adesea folosite ca vectori, deoarece au dezvoltat o modalitate de a capta și transmite genele lor celulelor umane, în cazuri patogene. Cercetătorii au încercat să profite de această proprietate a virusurilor și să manipuleze genomul viral, pentru a-l înlocui cu gene umane funcționabile. Anumite virusuri inserează genele proprii în genomul gazdei, fără a intra în celulă in timp ce altele penetrează membrana celulară. Odată ce gena este introdusă în celula umană, este afectată sinteza de proteine.
Transformarea unui virus într-un vector
Ciclul de viață al unui virus poate fi împarțit în două faze distincte: infectarea și replicarea. Infectarea este rezultatul introducerii genomului viral în celula gazdei. Acest lucru duce la o fază timpurie de expresie a genei, caracterizată prin apariția de produși reglatori virali, urmată de o fază târzie, când genele structurale sunt exprimate și apare formarea de noi particule virale. În cazul terapiei genice cu vectori, particulele virale înglobează un genom modificat, ce conține o genă terapeutică, în locul genomului viral. Transducția este definită ca o infecție non-replicativă, care introduce informație genetică funcțională, exprimată de către vectorii recombinanți în celula țintă. O altă metodă de terapie ar putea fi Editarea genomică.
Editarea genomică este modalitate specifică și precisă de modificare a ADN-ului unei celule/organism. Spre deosebire de terapia genică convențională, care utilizează în special vectori virali, care se inseră aleatoriu în genom, editarea genomică folosește enzime cunoscute ca nucleaze programabile ce corectează defectul la locul de origine, neinfluențând alte gene. Editarea genomică utilizează tehnologii prin care o secvență mutantă de ADN este modificată fiind astfel refăcută secvența normală.
Editarea se poate face în atât în celule somatice mature, cât și în celule embrionare. Este preferată însă manipularea prin această tehnică a celulelor somatice în special din cauza implicațiilor etice care apar în cazul utilizării celulelor embrionare, dar și datorită unei dificultăți mai mari de procurare a acestora. Fundamentul editării genomice se referă la producerea ghidată a unei rupturi bicatenare a ADN cu ajutorul nucleazelor programabile obținute prin tehnici de inginerie genetică. Ruptura activează mecanismele celulare normale de reparare a ADN care refac secvența normală prin modificări precise: adăugarea, excluderea sau înlocuirea unor nucleotide.
Cele două tipuri de procese reparatorii ce intervin sunt: recombinarea omoloagă (HR) – un mecanism precis ce utilizează pentru reparare catena de ADN intactă de pe cromatida soră sau de pe cromozomul omolog și unirea neomoloagă a capetelor (NHEJ) – un mecanism predispus la erori (inserții/deleții), capetele rupte ale ADN fiind unite fără omologie sau cu ajutorul unor secvențe omoloage scurte (10 pb). Există 3 tipuri de sisteme utilizate în editarea genomică : ZNF (zinc finger nuclease), TALEN’s (transcription activator-like effector nucleases ) și CRISPR-Cas9 (cel mai utilizat și cel mai bine cunoscut).
Sistemul CRISPR-Cas9 este cunoscut ca fiind un așa-numit “sistem imunitar specific” al bacteriilor, descoperit pentru prima dată la specia Streptococcus pyogenes. Cercetătorii au observat existența unui sistem enzimatic în celula bacteriană, care în momentul infectării acesteia cu un bacteriofag, clivează secvența de ADN a acestuia și inseră în niște situsuri specifice din cromozomul bacterian anumite secvențe de ADN viral. În cazul unei viitoare infectări cu același bacteriofag, enzima din componența acestui sistem, ghidată de un ARN complementar cu secvența de ADN viral inserată în cromozomul bacterian va identifica respectiva secvență în genomul bacteriofagului și îl va cliva. Denumirea acestui sistem provine de la cea a unor secvențe specifice din genomul bacterian (CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, Cas-9 = asociat cu nucleaza 9). Sistemul CRISPR-Cas9 prezintă 2 componente : o secvență ARN ghid – ARNsg complementar cu ADN –ul țintă, acest ARN recunoscând și legându-se în vecinătatea unor secvențe specifice (PAM (protospacer adjacent motif) și o enzimă - endonucleaza cas9, care poate fi modificată în diferite scopuri.
Sistemul CRISPR-Cas poate fi utilizat în diverse strategii terapeutice, cum ar fi:
1. Sistemul clasic CRISPR-Cas9 – nucleaza induce o breșă bicatenară celula repară ruptura și astfel este introdusă gena normală.
2. Sistem CRISPR-Cas9 cu o enzimă Cas9 modificată inactivă care se fixează la un anumit sit și blochează transcrierea (oncogene).
3. Sistem CRISPR-Cas9 la care se adaugă o proteină activatoare a expresiei genei amplificarea expresiei genei respective (gene supresor de tumori) .
4. Imunoterapia cancerului – introducerea de gene care să stimuleze activitatea limfocitelor T și să le ghideze către eliminarea celulelor tumorale.
Un exemplu de aplicație a sistemului CRISPR-Cas9 în tratarea cancerului indus viral. Unul din cele mai frecvente și periculoase forme de cancer întâlnite la femei este cancerul cervical, a cărei apariție este indusă în cele mai multe cazuri de infecția cu virusul HPV (Human Papilloma Virus). Acest virus exprimă o serie de oncogene virale : E6 (silențierea ei duce la reactivarea căii p53 ducând la senescență celulară și apoptoză), E7 (silențierea acesteia duce la restabilirea căii de semnalizare pRb ducând la instalarea senescenței celulare), E5 (mai rar). Celulele tumorale cervicale necesită exprimarea genelor E6 și E7 pentru a supraviețui.
Pentru tratarea acestui tip de cancer prin terapie clasică s-au încercat diferite strategii :
Ø introducerea în celule a peptidelor antagoniste pentru E6 și E7
Ø reintroducerea genei normale Tp53 în celulele tumorale
Ø utilizarea ARN de interferență
Din spectrul strategiilor care au implicat CRISPR-Cas9, putem aminti:
Un alt exemplu de utilizare a sistemului CRISPR-Cas9 este tratarea infecției latente cu EBV (Epstein-Barr Virus) care poate duce la instalarea limfomului Burkitt sau a carcinomului nazofaringeal. Genele virale implicate în transformarea malignă sunt : EBNA1/2 (EBV nuclear Ag), LMP1/2 (latent membrane proteine). Strategiile bazate pe CRISPR-Cas9 au fost aplicate pe celule provenite de la pacienți cu limfom Burkitt. În urma editării genomice s-a constatat reducerea proliferării celulare și reducerea încărcăturii virale (aproape eliminarea completă a virusului). De asemenea infecția cu HBV (virusul hepatitei B) a reprezentat un domeniu de interes pentru dezvoltarea unor strategii de tratament cu ajutorul CRISPR-Cas9 din pricina rezistenței la tratament medicamentos clasic datorată structurii de cccADN a genomului viral. Sistemul CRISPR-Cas9 s-a dovedit ideal pentru inactivarea genelor virale.
Alte tipuri de cancer tratabile cu ajutorul CRISPR-Cas9: carcinomul Merkel (Merkel cell polyomavirus) și sarcomul Kaposi (indus de infecția cu Human Herpes virus 8). Recent s-au dezvoltat sisteme CRISPR effector C2C2 pentru virusurile ARN (HCV, virusul limfotrofic TI) care realizează editarea ARN nu ADN.